多组学在呼吸重症相关领域的应用

作者：吴小静

单位：中日医院呼吸与危重症医学科

多组学技术是涵盖多个研究层面的综合技术体系，主要包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学（含脂质组学）以及微生物组学，同时还纳入了可穿戴设备所获取的表型数据。基因组学聚焦全基因组序列及DNA序列变异研究；表观基因组学致力于DNA及其缠绕组蛋白化学修饰的完整编目；转录组学通过测量细胞或细胞群中的完整RNA转录本集及其数量，反映细胞状态；蛋白组学对样品中所有蛋白质进行鉴定和丰度定量分析；代谢组学针对体内质量＜1500 Da的小分子展开研究，脂质组学作为其分支，关注脂质在生理代谢与病理状态下的动态变化；微生物组学则围绕微生物群落的构成与功能开展研究；可穿戴设备借助传感器实现对重要生理参数的连续纵向监测，为多组学研究提供丰富的表型数据支持。

自20世纪中后期起，多组学技术逐步发展。进入21世纪后，得益于检测技术的持续进步与检测成本的不断降低，多组学技术在近20年实现了快速发展，广泛应用于多个行业，在医学健康领域更是展现出巨大潜力，为疾病研究与临床诊疗提供了全新的视角和方法。

1. 疾病机制探索：更新认知，提供新思路

在呼吸危重症疾病机制研究方面，微生物组学的应用彻底改变了人们对肺炎发生机制的传统认知。传统观念认为肺是无菌脏器，肺炎是病原微生物进入下呼吸道后，突破宿主防御并大量繁殖所致。而基于微生物组学的研究提出了肺微生态假说，证实肺并非无菌脏器，其存在特定的微生态环境（图1）。肺炎的发生实际上是肺部致病微生物数量增加、生物多样性降低及宿主炎症反应引起的微生态失代偿状态。微生物进入气道（微误吸黏膜扩散）、微生物从气道中的消除（咳嗽、纤毛清除、宿主防御）、微生物的相对繁殖率（这取决于该区域的生长条件）这三个因素的平衡决定并塑造了肺微生态。

图1  VAP传统范式与新范式

图源：EBioMedicine, 2020, 60:102995. 

为了深入探究呼吸机相关性肺炎（VAP）的发生机制，笔者团队开展了微生物组时空变化与VAP关系的研究。研究对象为ICU内气管插管患者，在插管24 h内及之后每48 h，分别从口咽拭子（OPS）、声门下分泌物（SGS）和气道抽吸物（ETA）三个部位采集样本，并进行微生物组测序与临床资料采集。结果显示，从气管插管到VAP发生，致病微生物会从上呼吸道逐渐移位至下呼吸道，且下呼吸道微生物多样性逐渐消失，微生态受损。在插管第1天，致病微生物主要存在于口咽样本中，ETA样本中生物多样性丰富；随着插管时间的延长，致病微生物逐步向下呼吸道迁移；当发生VAP时，ETA中致病微生物数量显著增多，生物多样性明显减少；经过治疗VAP改善后，ETA中致病微生物数量减少，生物多样性则随之增加。

这一机制认知的转变也为VAP诊疗带来了新思路。传统诊疗观念以清除局部病原体为主要目标，而基于微生态假说的新观念认为，VAP是病原体、内源性微生物群落与免疫系统竞争肺生态定植点位的结果。过度依赖局部强化抗菌治疗，可能会破坏内源性微生物群落，引发中长期不良后果。基于此，有学者提出使用益生菌预防VAP的设想，并开展了相关研究。2015年Intensive Care Med 杂志发表的一项针对150例PICU患儿的开放标签随机对照试验显示，接受预防性益生菌治疗的患儿VAP发生率（17.1%）显著低于对照组（48.6%），且ICU住院时间、机械通气时间等指标也更优。然而，2021年JAMA杂志发表的一项44个ICU内2650例成年患者参与的随机对照试验中，益生菌治疗组与安慰剂组的VAP发生率无显著差异（21.9% vs 21.3%）。尽管成人研究未取得阳性结果，但也为VAP的预防和治疗提供了新的研究方向。

2. 疾病诊断：提升鉴别能力，优化诊断效能

在呼吸危重症疾病诊断中，病毒感染及细菌与病毒混合感染的鉴别诊断是临床实践中的难点问题。研究发现，病毒是重症社区获得性肺炎（SCAP）的首要病原微生物，且细菌和病毒混合感染较为常见，此类患者病死率更高。同时，抗感染治疗延迟与抗生素滥用均会对患者预后产生不利影响。传统的细菌/病毒肺炎鉴别生物标志物（如PCT、CRP）存在较多干扰因素，诊断效能有限。

为了解决这一难题，研究人员尝试利用多组学技术建立更优的诊断模型。在转录组学方面，有研究通过外周血宿主转录组测序构建了细菌感染、病毒感染、细菌/病毒混合感染及非感染性疾病的诊断分类器模型，并将特征性宿主基因转化为RT-PCR检测试剂盒。外部验证结果表明，该试剂盒在细菌感染诊断效能方面与PCT相当，但在病毒感染、细菌/病毒混合感染及非感染性疾病的鉴别诊断方面显著优于PCT。另有研究针对细菌和病毒感染引起发热的患者，利用外周血标本进行转录组学分析，筛选出IFI44L和PI3两个具有鉴别诊断意义的宿主基因，基于这两个基因建立的鉴别诊断分类器模型，其AUC值在内部验证中达到0.969（敏感性0.891，特异性0.971），外部验证AUC值为0.986（敏感性0.857，特异性0.954），诊断效能明显优于PCT和CRP。

除转录组学外，蛋白组学、代谢组学在细菌/病毒肺炎鉴别中也发挥着重要作用。研究发现，病毒性肺炎患者中亚油酸衍生的炎症信号代谢物（EpOME和DiHOME）水平升高，参与细胞免疫反应和细胞凋亡的蛋白质（LAG-3和TRAIL）表达上调；而细菌肺炎患者在模式识别受体（CLEC4D和EN-RAGE）方面显著升高。此外，多种脂质（如胆汁酸、甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰胆碱等）在病毒性和细菌性肺炎患者体内存在显著差异，这些差异指标为细菌/病毒肺炎的鉴别诊断提供了更多潜在的生物标志物。

3. 疾病分型：实现精准分型，指导个体化治疗

呼吸危重症患者（如脓毒症、ARDS、SCAP等）具有高度异质性，传统基于临床数据的分型方法在指导精准治疗方面存在局限性。多组学技术的应用为呼吸危重症患者的精准分型提供了有力工具，有助于实现个体化治疗。

在脓毒症分型研究中，有研究团队对入住荷兰和英国ICU的脓毒症患者进行全血基因组分析，在发现队列和两个验证队列中识别出4个与脓毒症28天病死率相关的内型（Mars1-4），其中Mars1内型与28天病死率密切相关。同时，研究人员还筛选出BPGM和TAP2两个可靠的生物标志物，可用于Mars1内型患者的识别，为脓毒症患者的风险分层和治疗方案选择提供了重要依据。

在COVID-19严重程度分型方面，研究人员对102例COVID-19患者（其中轻症51例、重症51例）和26例非COVID-19患者（轻症13例、重症13例）的血浆样本进行蛋白组学、代谢组学、脂质组学和转录组学分析，解析了COVID-19重症化的生物学过程，主要涉及中性粒细胞脱颗粒、血管损伤、血小板活化与脱颗粒、血液凝固以及急性期反应等。基于多组学数据开发的预测COVID-19严重程度的机器学习模型显示，多组学组合模型的预测效能最优，能够更准确地对COVID-19患者的病情严重程度进行分型。

多组学分型在指导脓毒症液体管理方面也取得了显著进展。一项研究纳入352例脓毒症患者（训练集），其中255例患者在第1天接受宽松液体策略，97例接受限制性液体策略。通过蛋白组学分析识别出可从不同液体策略中获益的患者亚组，并结合全血转录组、液体治疗策略和生存结局，为每位患者计算“获益评分”（Benefitscore），评分越高，越支持限制性液体治疗。在142例患者组成的验证集中，将获益评分推荐的治疗策略与实际治疗策略进行比较，结果显示，推荐策略与实际策略一致的患者，其生存结局最优；而推荐宽松液体策略但实际采用限制性液体策略的患者，生存结局最差。这一研究结果表明，基于多组学的分型能够为脓毒症患者的液体管理提供精准指导，改善患者预后。

4. 预后分析: 挖掘预后标志物, 提高预测准确性

准确预测呼吸危重症患者的预后，对于临床治疗决策制定和医疗资源合理分配具有重要意义。多组学技术能够从基因、蛋白、代谢等多个层面挖掘与患者预后相关的生物标志物，建立预后预测模型，显著提高预后预测的准确性。

在脓毒症预后预测研究中，有研究对265例脓毒症患者（发现队列）和106例脓毒症患者（验证队列）的外周血样本进行转录组学分析，通过无监督聚类方法定义了两个不同的脓毒症反应特征（SRS1和SRS2）。其中，SRS1特征包括内毒素耐受、T细胞耗竭和人类白细胞抗原（HLA）Ⅱ级下调等。结果显示，无论是在发现队列还是验证队列中，SRS1型患者的14天存活率均显著低于SRS2型患者，这为脓毒症患者的预后评估提供了重要指标。

在SCAP患者预后预测方面，笔者团队对239例SCAP患者（建模队列）和105例SCAP患者（外部验证队列）进行微生物组学和代谢组学分析。结果发现，死亡组患者早期白介素-17（IL-17）和肿瘤坏死因子（TNF）等炎症相关通路被激活，而ABC转运蛋白代谢途径受到抑制；同时，死亡组患者早期主要激活固有免疫的中性粒细胞相关生物过程，存活组患者则主要激活适应性免疫的淋巴细胞相关生物过程。基于宿主转录组构建的非免疫抑制SCAP患者预后预测分类器，内部验证集AUC值为0.838，外部验证集AUC值为0.739，预后预测能力优于临床常用的APACHEⅡ评分和SOFA评分。此外，研究还发现，存活组和死亡组患者微生物构成存在一定差异，但两组患者生物多样性无显著性差异，肺微生物组特征对提示患者预后的作用有限。

在ARDS患者预后生物标志物筛选研究中，我国研究人员对比了ARDS存活组、ARDS死亡组、疾病对照组和健康对照组的蛋白组学和代谢组学特征。结果显示，ARDS患者存在特征性蛋白表达变化，且有214种代谢物异常，其中以溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）减少和鞘脂通路（1-磷酸鞘氨醇S1P下降）紊乱最为显著。从36种候选生物标志物中筛选出8个与预后密切相关的特异性蛋白，分别建立蛋白组模型、临床模型和蛋白组+临床模型。结果表明，蛋白组模型的预后预测效能优于临床模型，而蛋白组+临床模型的预后预测效能最优，为ARDS患者的预后评估和治疗方案优化提供了有力支持。

尽管多组学技术在呼吸危重症领域取得了显著进展，但在实际应用过程中仍面临诸多挑战，主要体现在以下几个方面：

（1）“大数据”挑战：多组学研究产生的数据量庞大，涵盖基因、蛋白、代谢等多个层面的信息，数据储存压力巨大。同时，多组学数据具有高度复杂性和异构性，不同组学数据的类型、格式和维度差异较大，给数据整合与分析带来极大困难。此外，如何对海量的多组学数据进行合理解释，挖掘其中蕴含的生物学意义和临床价值，也是当前面临的重要挑战。

（2）样本采集和组学数据分析缺乏标准化：缺失值、样本缺失、数据复杂性、类不平衡、数据集偏移、批次效应以及某些数据类型的不可用。

（3）数据集的异构性和复杂性增加，需要深度学习、数据挖掘和人工智能方法来集成和解释它们。

（4）多模态数据的复杂性和规模需要强大的数据管理系统，以确保足够的数据处理能力、隐私性和安全性。

样本质量是多组学研究的基础，直接影响研究结果的可靠性和准确性。在呼吸危重症研究中，支气管肺泡灌洗液（BALF）是重要的样本类型，但不同中心的BALF样本质量差异较大。一项针对22家中心124例SCAP患者BALF样本的研究显示，仅55%的BALF样本符合最基本的测序要求（Core_gene_mapped_reads＞200k）。同时，样本采集过程缺乏统一标准化流程，分中心培训与否对样本质量影响显著，经过培训的分中心，其样本质量显著优于未经过培训的分中心。此外，样本储存时间也会影响样本质量，外周血白细胞RNA和BALF细胞RNA的不合格率均随储存时间的延长而升高。

多组学技术在呼吸危重症领域的应用广泛，为疾病机制探索、诊断、分型和预后分析提供了全新的方法和视角，推动了临床精准诊疗的进步。随着深度学习、人工智能和云计算技术的不断发展，其与多组学技术的结合将在多组学数据的综合分析、解释和可视化中发挥关键作用。最终目标是为临床医生提供自动化、实时和可解释的平台，协助医生进行疾病诊断、制定治疗策略和判断预后，进一步提升呼吸危重症的诊疗水平，改善患者预后。

作者介绍

吴小静

中日医院呼吸与危重症医学科主诊医师，副主任医师，医学博士，硕士生导师，美国南加州大学医学院访问学者；主要研究方向为重症肺炎和血流感染的诊治及发病机制；以第一/通讯作者身份发表论文20余篇，作为主要执笔人撰写指南/专家共识5项，主持国家级课题1项、省部级课题2项；作为骨干成员获2023年“全国创新争先奖牌”。