通过内标分子进行人源/病原核酸定量宏基因组测序与肺炎诊断

周华王珺刘超浙江大学医学院附属第一医院杰毅生物发布于2022-02-16 浏览 3474 收藏

【摘要】 病原宏基因组测序（mNGS）通过对临床疑似感染患者标本中提取的总核酸进行无偏倚的鸟枪法测序（shotgun sequencing），获得的测序数据先过滤人源序列，再与微生物基因组数据库进行比对分析，汇报样本中的微生物种类和序列数（最佳比对或严格比对至某微生物属/种的核酸片段数）。因为测序过程是无偏倚的，理论上可以覆盖样本中所有已知基因序列的微生物，因此mNGS可以检测上万种病原微生物（细菌、病毒、真菌、寄生虫），具有常规靶向检测（微生物培养、抗体/抗原、PCR、16S/18S测序等）所不具备的无需假设、广覆盖的优点。

宏基因组测序（mNGS）通常汇报微生物的序列数（序列数reads或每百万reads中的序列数RPM），然而，mNGS的测序过程是对文库中的核酸进行无偏好性的等比例抽样，最终测序的核酸只占文库中所有核酸的千分之一甚至更低^[1]，因此，mNGS对样本中微生物的检测性能取决于两个因素：人源核酸含量与病原核酸含量。人源核酸含量越高，微生物的检测性能越差。在恒定的测序数据量下（共识推荐20M reads^[2]），人源核酸含量高的文库中，相同含量的微生物序列数会低于人源核酸含量低的文库。为解决临床标本中人源核酸对微生物检测的影响，去宿主/去人源技术被广泛用于临床mNGS检测，目前主要的去宿主技术是差异化裂解，通过皂苷（saponin）一类的化学物质选择性裂解人细胞，再通过核酸酶处理释放出的人源核酸，从而对微生物进行富集^[3]。但这种处理方式可能会造成某些微生物的损失（比如肺炎链球菌），从而产生假阴性结果^[4]。在本研究中，我们通过向肺泡灌洗液中加入内标核酸分子，对每份标本中的人源核酸和微生物核酸进行相对定量，从而对人源含量和病原含量实现标化（Q-mNGS）。我们还对Q-mNGS的检验性能与诊断性能在205例疑似下呼吸道感染的患者中进行了前瞻性的临床研究，同时比较了去宿主前后微生物检测性能的差异。

材料和方法

1. 患者入组

我们纳入了2020年2月至5月间中国浙江省内总计205例患者。入组条件为：①初步诊断为肺炎（胸部X线片或CT提示肺炎性改变），伴有咳嗽、咳痰、发热、气促等症状；②患者同意进行纤维支气管镜检查并且可以采集至少10 ml肺泡灌洗液；③患者签署知情同意书，自愿参与本研究项目。感染RNA病毒（包括但不限于新冠病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒）的患者被排除，因为新冠疫情期间此类患者被移送至具备严密隔离措施的特殊病区。每位患者在采集肺泡灌洗液后，进行Q-mNGS实验。本研究通过了浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会的审批（伦理批件号IIT20200032A）。

2. 内标核酸制备

合成后的双链内标DNA分子通过PCR扩增（TAKARA PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase, R044）和磁珠纯化（Matridx, MD012）制备。所有操作在生物安全柜中进行，纯化后的内标分子进行Qubit荧光定量（Thermo Fisher, Qubit™ dsDNA HS Assay Kit, Q32854）。肺泡灌洗液中加入的内标分子终浓度为0.02 ng/μl。

3. AO/PI双色荧光细胞计数

为明确每份肺泡灌洗液标本中人源细胞的数量，我们使用吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）双色荧光染色（ALIT Life Science, Countstar® Rigel S2）对标本中的有核细胞进行计数（AO染料可以渗透细胞膜，与细胞核结合产生绿色荧光。PI无法渗透细胞膜，只能进入死亡或凋亡细胞，与细胞核结合产生红色荧光）。

4. 人源宿主细胞去除

皂苷（Tokyo Chemical Industry, S0019）加入标本后（20 μl 10%皂苷加入200 μl肺泡灌洗液，终浓度为0.9%）混匀，在室温放置10 min。之后加入200 μl去核酸酶纯水，继续在室温放置30 s，再加入5 μl 5M的NaCl溶液进行渗透压冲击。加入45 μl反应液（25 mM MgCl₂, 2.5 mM CaCl₂）和5 μl DNase I（3000 U/ml, TIANGEN）对人源核酸进行消化（37°C 15 min，500 r.p.m震荡）。最后在溶液中加入20 μl 0.25M EDTA，70°C处理5 min对DNase I进行灭活。

5. 文库构建与mNGS

DNA文库通过自动核酸提取建库仪进行制备（Matridx, MA002），包含核酸提取、酶切片段化、补平加A、接头连接和纯化^[5]。文库在荧光定量PCR（KAPA）定量后进行等量混合和高通量测序。测序平台为illumina Nextseq，每个文库平均数据量10 M，读长75 bp，双barcode测序，每张测序芯片包含一个阴性对照（每毫升104 Jurkat细胞培养液）。

6. 微生物汇报阈值与人源指数

微生物汇报的基础阈值为：①质控合格（文库浓度高于50 pM，Q20>85%，Q30>80%）；②阴性对照未检出此微生物或RPM（样本）/RPM（阴性对照）≥5。每个文库中，内标分子的RPM记为SRPM，人源序列RPM记为HRPM（参考基因组GRCh38.p13），人源指数（Host index）计算公式为Log₂（HRPM/SRPM）×1000。

研究结果

1. 微生物的序列数（RPM）与样本中人细胞浓度成反比

通过对模拟标本（微生物标准品与人源细胞混合）的测试可以看出，mNGS测序后相同含量微生物的序列数（RPM）随着样本中人细胞浓度的升高而降低，而这一现象与PCR建库或PCR-free建库无关，且两种建库方法对微生物的序列数没有影响（图1）。

图1 PCR与PCR-free建库与不同人源含量对微生物序列数的影响

注：A. 铜绿假单胞菌；B. 近平滑假丝酵母

因此，可以通过对每份标本中加入含量恒定、序列已知的内标核酸对标本中的人源和病原核酸进行相对定量，从而明确不同标本中的人源和病原含量（图2）。

图2 通过内标分子进行人源与病原核酸定量原理示意

2. Q-mNGS内标分子的筛选与评估

我们制备了5种不同序列、不同长度的内标分子（spike）进行测试，可以看出，内标分子的检出序列数与投入量成正比，与人源细胞浓度成反比，且具有较好的一致性和重复性（图3）。

图3 内标分子检出序列与投入量和人源细胞浓度的关系

因此，我们选用spike 1进行后续实验。205例疑似肺炎患者的肺泡灌洗液被分别加入等量的spike 1，同时进行AO/PI有核细胞计数。从图4可以看出，spike 1的检出序列数与临床标本的细胞计数成反比，人源指数（host index）与细胞计数成正比，因此可以通过人源指数来反映不同标本中的人源核酸含量。

图4 内标分子序列数、人源指数与标本有核细胞计数的相关性

注：A. 内标序列数；B. 人源指数

3. 差异化裂解去宿主对mNGS检测性能的影响

我们对差异化裂解去宿主对微生物检出的情况进行了比较分析，每份肺泡灌洗液被均分为两份，一份正常检测，另一份在去宿主后进行检测。去宿主操作造成了某些微生物的序列数上升，某些微生物的序列数下降，相比真菌和病毒，细菌与分枝杆菌的序列数提升更为显著（图5）。我们发现了总计8例（3.90%）标本在去宿主后检出病原微生物，在去宿主前并未检出（4例结核分枝杆菌，2例烟曲霉，2例白色假丝酵母）。同时，去宿主也造成了微生物的损失，例如耶氏肺孢子菌，在2例标本中，去宿主造成了耶氏肺孢子菌序列数的显著下降（RPM分别下降7695.87与8397.47）。

图5 差异化裂解去宿主对微生物检测性能的影响

4. Q-mNGS的诊断性能评估

为了评估Q-mNGS的诊断性能，我们使用了多种临床常规的病原学检测技术作为正交对照，包括细菌、真菌培养，抗酸染色，G/GM/GXM试验，PCR检测（结核分枝杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、巨细胞病毒）。常规检测在64例标本中检测阳性（64/205，31.22%），其中51例的检测结果与Q-mNGS一致（51/64，79.69%）。共计5例标本常规检测阳性（1例新型隐球菌，4例结核分枝杆菌），而Q-mNGS检测阴性。当常规检测为阴性时，临床诊断通过至少两位医师结合Q-mNGS结果、患者临床表现、胸部CT、经验性抗生素治疗效果等进行综合评判。205例患者的临床情况见表1，有15例（7.32%）患者被确诊为非感染性疾病，剩余190例被诊断为感染性疾病，其中115例患者有明确的病原学依据（图6）。在明确病原体的115例患者中，Q-mNGS的检测阳性率为93.04%，常规检测的阳性率为49.57%。在诊断性能方面，Q-mNGS为123例患者提供了有效的诊断依据（123/205，60.00%），其中有64例患者的常规检测为阴性，Q-mNGS的结果为唯一的病原学依据。常规检测为67例患者提供了诊断依据（67/205，32.68%），其中有8例患者的常规检测结果为唯一的病原学依据（图6）。

表1 入组患者临床信息

图6 Q-mNGS与常规检测的诊断性能对比

讨论与分析

我们发现Q-mNGS在肺脓肿（尤其是厌氧菌造成的肺脓肿）、肺结核、肺曲霉病、细菌性肺炎（主要是肺炎链球菌）、耶氏肺孢子菌肺炎、肺炎支原体/衣原体、非结核分枝杆菌肺病感染诊断中具有显著优势，因为此类病原体的常规检测并非在所有医院都普遍开展（如六胺银染色、支原体/衣原体检测、厌氧菌培养等）或耗时很长（分枝杆菌的培养）。另一方面，Q-mNGS的阴性结果对临床排除感染也具有一定价值。本研究中通过mNGS协助诊断了93.33%（14/15）的非感染性疾病，包含6例间质性肺炎、4例肺癌、1例心脏衰竭、1例过敏性肺炎、1例慢阻肺、1例放射性肺炎。在这些患者标本中，Q-mNGS的检测结果主要是常见的呼吸道定植菌（如嗜血杆菌属、链球菌属、普雷沃氏属、放线菌属），常见表皮定植菌（如丙酸杆菌属、马拉色菌属），以及人疱疹病毒、假丝酵母和细环病毒等。

通过本研究，我们认为在临床开展mNGS前，医生应充分了解此项技术的优缺点，mNGS的主要优点是广覆盖，尤其在混合感染和罕见病原体感染的诊断中具有很高的价值。但正是因为mNGS的广覆盖，在结果判读中需要掌握微生物学和呼吸道感染相关知识。此外，去宿主操作对微生物检测的影响是一把双刃剑，因此在实验中需要谨慎开展，并且对其性能进行充分的验证和评估。

参考文献

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[2]李颖，麻锦敏．宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识（第一版）[J]. 中华危重病急救医学，2020，32（5）：531-536.

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