宏基因组二代测序在脓毒症病原体诊断中的应用进展

发布于2024-02-29 浏览 2766 收藏

作者：杨翔1, 2，郭兰骐1，谢剑锋1，邱海波1

单位：1. 东南大学附属中大医院重症医学科；2. 解放军东部战区总医院干部病房一科

本文来源：《中华重症医学电子杂志》2023年第9卷第3期

脓毒症是机体对感染反应失衡而导致的危及生命的器官功能障碍。每年脓毒症影响全球5500万患者，并导致每年1100万人死亡。早期、适当的抗生素使用是降低脓毒症患者病死率的关键。然而，在脓毒症抗感染治疗最初阶段，常常会采用经验性广谱抗生素，从而导致了抗生素的滥用。因此，快速、准确识别致病菌在脓毒症的诊疗中至关重要。

当前病原体的确定主要依赖于培养法、涂片镜检法、病原体抗体检测、特定病原体多重聚合酶链反应（PCR）检测等。培养法仍是诊断大多数感染的首选方法，然而，当前仍有25%~70%的感染性疾病患者无法明确病原体。此外，某些新发的感染性疾病如埃博拉出血热、新型冠状病毒感染等，也无法通过传统方法诊断。宏基因组二代测序（mNGS）作为一种新型测序方法，于2014年首次被报道用于协助诊断感染性疾病，其优势包括同时检测样本中已知及未知的所有病原体、早期识别混合性感染、检测耐药基因突变及发现并追踪新的病原体，特别适用于病情危重需尽快明确病原体的脓毒症患者。本文综述了mNGS在各类感染性疾病诊断中的应用，总结当前的研究进展及存在的问题，促进其在脓毒症病原体诊断方面的合理应用。

一

mNGS的原理简介

mNGS的技术核心思想是“边合成、边延伸、边测序”，通过捕捉到的合成链末端的荧光信号或氢离子释放所致pH值变化信号来获取核酸序列。主要流程如下：首先将检测样本全部基因组的核酸处理成序列长度为100~1000 bp的片段；其次通过桥式或乳液PCR等方式建立基因文库；然后利用焦磷酸测序法、链接测序法和可逆终止子法等手段边合成、边测序，获得合成链的DNA、RNA序列；最后通过生物信息学软件进行分析，确定序列质量信息，与已知的参考基因作比对、定位以及整合分析，获得目标核酸的完整序列。

二

mNGS在各类感染性疾病所在系统中的诊断应用

1. 中枢神经系统

引起中枢神经系统（CNS）感染的潜在病原体多种多样，超过一半的疑似感染性脑膜炎患者无法明确病原体。2014年Wilson等首次报道利用mNGS确诊钩端螺旋体感染的脑炎病例，打响了mNGS检测病原体的第一枪。脑脊液样本背景简单、宿主核酸干扰小，使得脑脊液mNGS准确性高，可作为病情危重的急性CNS感染患者的一线检测手段。

2019年一项多中心、前瞻性研究通过对难以确诊的204例CNS感染患者进行传统方法及脑脊液mNGS比较发现，mNGS提高了CNS感染的确诊率，并提供了精确、及时的治疗证据，特别是复杂的CNS感染。此外，mNGS为非典型病原体CNS感染的早诊断、早治疗提供了新的方法。Yu等研究发现，mNGS诊断结核性脑膜炎的敏感度为43.5%，特异度为100.0%，较结核分枝杆菌特异性PCR有更高的检出率，能快速、精准地诊断结核性脑膜炎。另外，mNGS检测可以用于CNS感染与自身免疫性脑炎的鉴别诊断。

然而，mNGS仍不能完全取代传统检测方法，特别是对于隐球菌性脑膜炎。Xing等的研究发现mNGS诊断隐球菌性脑膜炎的敏感度低于传统印度墨汁染色，这可能与隐球菌的厚荚膜没有被充分破坏、DNA无法充分释放有关。

2. 血液系统

血培养是诊断血流感染（BSI）的金标准，但由于血液中病原菌含量过低、特殊病原菌无法培养、培养前接受抗生素治疗等因素，血培养诊断BSI的阳性率仅在20%左右。mNGS能快速分析血液样本中全部病原体，早期、准确地明确致病菌，以指导合理使用抗生素。Grumaz等通过对比239份血清mNGS及256份血培养结果发现，mNGS阳性率（71%）明显高于血培养（11%），且有53%的患者依据mNGS结果指导抗生素的使用。另外，mNGS阴性结果可作为BSI的排除依据。Jing等对209例怀疑BSI患者进行回顾性研究发现mNGS阴性预测率（NPV）为88.6%。

然而，几乎所有的血液mNGS结果都包含大量的微生物序列，这些微生物序列中包含了皮肤定植菌及试剂污染所带来的病原体，而这些可疑的“污染菌”与BSI常见致病菌属类似，给mNGS阳性结果的判读带来挑战。Hogan等研究中，在50份mNGS阳性结果中，仅6例（7%）对治疗产生了积极的影响，另有3例（3.7%）产生了不利的影响。另外，由于有较厚细胞壁的病原体核酸提取率低等因素，mNGS对BSI诊断的假阴性率并不低。在微滴式数字PCR（ddPCR）的病原菌检测范围内，ddPCR的阳性率、敏感度及检测速度均优于mNGS。由此可见，虽然mNGS在BSI诊疗中得到了推广，但当前其主要用于严重BSI的早期诊断及对血培养等病原体检测手段的补充及验证。

3. 循环系统

快速、准确的病原学诊断及正确的抗生素使用是感染性心内膜炎治疗的基石，感染性心内膜炎患者血培养阳性率为50%~75%，由于血培养检测时间长及血培养前已使用抗生素等因素，血培养并不能满足临床需要，特别是早期指导感染性心内膜炎的治疗。血浆mNGS可早于血培养检测出感染性心内膜炎血液中的病原体，但临床可行性仍存争议。一项针对10例感染性心内膜炎患儿的研究中血浆mNGS的阳性率为80%，而血培养的阳性率仅为30%。与之相较，Lee等研究却发现，血浆mNGS确定的病原体仅一半与感染性心内膜炎相关，且在7例阴性结果中有4例血培养阳性。可见血浆mNGS尚不能独立诊断感染性心内膜炎。

相较之下，瓣膜组织mNGS是感染性心内膜炎病原学诊断的可靠方法。Cheng等对比41例确诊感染性心内膜炎患者的瓣膜组织mNGS及培养结果，mNGS对致病菌的检出率为97.6%，而培养的检出率仅为30.8%，mNGS检测出的病原菌在种及属水平的一致性为100%。Cai等回顾了行心脏瓣膜手术的感染性心内膜炎患者及非感染性心内膜炎患者的瓣膜组织mNGS结果，感染性心内膜炎患者的mNGS的敏感度和特异度均为100%，而非感染性心内膜炎患者的mNGS结果均为阴性。这均表明瓣膜组织mNGS在明确感染性心内膜炎病原体的敏感度上远高于传统方法，特别适用于培养阴性感染性心内膜炎患者的病原体诊断。

4. 呼吸系统

在肺部感染的诊疗中，大约只有30%的患者可以通过呼吸道分泌物培养明确致病体。多项临床研究发现呼吸道分泌物mNGS可用来明确呼吸道感染的致病菌。最新的多中心前瞻性研究分析也证实了mNGS对细菌、DNA病毒的检测效能优于传统方法，并可通过检测呼吸道病原体的耐药基因指导抗生素的使用。其次，对特殊病原体感染的快速诊断，mNGS具有明显的优势。一项针对肺结核患者肺泡灌洗液进行的研究发现，mNGS可在3 d内确定67.23%的病例；再者，mNGS简化了多重病原体肺部感染的诊断流程，并可检出无法通过传统方法明确的病原体，如鹦鹉热衣原体。

除了呼吸道分泌物外，肺组织活检mNGS可协助判断肺局部感染（如肺脓肿、结核球、曲霉球等）的病原体，特别是细菌感染及多重感染。在特殊病原微生物感染时，肺活检组织mNGS较传统病理有更快的检出速度及精准度，对真菌感染的特异度达到了100%。

必须注意的是，mNGS呼吸道分泌物存在较多定植菌及背景菌，呼吸道分泌物mNGS诊断肺部感染的特异度较低，如何分析检测结果、提高诊断效能是当前的mNGS在肺部感染应用中的主要瓶颈。通过分析宿主反应可能是解决上述问题的途径之一。Langelier等利用mNGS分析肺部感染患者呼吸道分泌物中基因组信息发现，明确肺部感染患者的宿主反应相关基因表达明显高于未确定肺部感染的患者，该研究组在后续的研究中利用mNGS对急性呼吸衰竭患者的呼吸道分泌物进行病原体、气道微生物组学和宿主反应转录组学进行分析，自制Z-Score评分对下呼吸道感染及非感染的区分，通过该方法检测致病菌的准确性可达95.5%。

5. 运动系统

受限于骨关节植入物表面形成的生物膜、全身经验性抗生素及术中抗生素骨水泥的使用，关节液培养诊断骨关节感染的阳性率仅为40%~70%，特别是假体感染的病原体很难通过传统关节液培养来确定。相较之下，关节液及假体周围组织mNGS的病原体检出率可达到81.8%~100%。

其次，mNGS不仅为早期骨关节多重感染的治疗提供了病原学证据，降低了骨关节感染治疗失败率，并且依据mNGS结果指导骨关节感染抗生素的选择不仅是安全、可行的，更是解决骨关节感染治疗中抗生素滥用的潜在手段。Wang等依据关节液mNGS结果减少抗生素种类后不但没有导致假体感染治疗失败，而且减少了抗生素的不良反应并降低了成本。

然而，关节液体mNGS虽然检出混合感染，但检出的病原体无法确定是定植菌、致病菌或背景微生物，对于病原体存状态也无法确定。另外，mNGS对骨、关节结核的诊断方面也未展现出明显优势，这可能与结核分枝杆菌的细胞壁较难被破环有关。此外，当前mNGS在骨、关节感染中的研究仅局限于某单一类型样本上，如关节液、假体周围组织，尚无队列研究比较mNGS对不同类型样本的病原体检测能力，这都是未来持续研究的热点。

6. 消化系统

在消化系统感染中，腹腔感染所致的脓毒症有着较高的发病率和病死率，一直是重症患者治疗的难点，腹腔引流液培养是识别腹腔感染病原体最常用的方法，但其检测阳性率较低，只有不超过70%%的ICU腹腔感染患者通过适当的病原学培养优化抗生素治疗。腹腔感染往往是腹腔脏器，特别是肠道、胆道细菌进入腹腔定植、繁殖所致，由于肠道、胆道中微生物种类众多，腹腔引流液的mNGS结果难以判读出真正的致病微生物，因此，当前评价腹腔引流液mNGS诊断腹腔感染效能的研究较少。通过对腹腔感染引起的脓毒症患者的血浆mNGS与传统腹腔引流液培养进行对比后发现，虽然血浆mNGS的阳性率低于腹腔引流液培养，但血浆mNGS阳性患者预后较差，且入住ICU后48 h内接受抗生素治疗与mNGS检测相匹配的患者的临床结果优于未接受抗生素治疗的患者，这对血浆mNGS腹腔感染所致脓毒症患者早期恰当的抗感染治疗具有潜在的指导价值。

另外，在消化系统感染中，大肠埃希菌是重要的致病菌。不同种类的大肠埃希菌的菌株毒力及耐药性具有较大的差别，mNGS可通过检测菌株相应的特异性基因及耐药基因，为进一步抗感染方案制定及避免抗感染治疗失败提供证据。

7. 泌尿系统

mNGS在泌尿系统感染中对病原微生物的诊断价值与其他系统类似，且相关临床研究也较少。但在肾移植术后患者的尿路感染中，不管是尿液mNGS还是移植肾活检组织mNGS，可能都具有其重要的临床价值。移植肾功能不全特别是急性移植肾功能不全，移植肾感染都是其重要的致病因素，早期、适当的抗感染治疗，是控制移植肾感染，挽救移植肾功能的关键因素。然而，肾移植术后患者往往长期服用免疫抑制剂，条件致病菌及一些特殊且少见病原微生物导致的移植肾感染并不少见，传统检测方法并不能快速、广覆盖地明确致病微生物。虽然当前尚无相关临床研究支持，但无论是尿液还是移植肾活检组织mNGS都可能是弥补传统检测方法不足的重要手段。mNGS在移植肾感染病原微生物诊断及治疗价值评估方面也是潜在的研究热点。

三

存在的问题及解决方法

当前，制约mNGS检测推广最核心的问题是提高mNGS的敏感度及特异度。检测过程中的微生物核酸污染以及定植微生物会导致mNGS结果中含有大量非致病性微生物，降低诊断特异度。当前解决方法包括：首先，严格遵守操作流程、定期评估试剂、设置阴性对照、尽可能保持无核酸环境等措施，避免污染；其次，去除人源性细胞或核酸、增加测序深度以获取足够的微生物基因组数据，以提高mNGS的敏感度及特异度。另外，前文已提及通过分析宿主反应可能为提高mNGS的特异度提供了新的思路。最后，当前mNGS检测成本仍较高，外送检测周期较长，其结果仍需要用其他方法或感染相关的标志物进行验证，限制了mNGS作为常规检测技术的使用。

综上所述，mNGS能针对多种病原体提供快速、广泛、敏感度高的诊断，同时能对病原体的毒力、抗生素耐药基因及宿主反应深入分析，为脓毒症的个体化抗感染治疗提供准确、全面的病原体信息。尽管mNGS较传统检测的“先猜再测”模式有诸多优势，但由于其较高的检测成本及某些样本的检测敏感度不足，mNGS仍不能完全取代传统方法。如何提高mNGS在高人源性细胞或含有大量定植菌样本中致病菌检出率及如何判定检测结果中致病菌仍是当前mNGS面临的困难及研究热点。随着mNGS相关专家共识的逐步完善、测序技术的发展及检测成本的逐渐降低，mNGS有望成为脓毒症患者病原学诊断的常规检测技术。

参考文献略

后可发表评论

全部评论 0