冷冻肺活检联合mNGS检测在弥漫性肺疾病鉴别诊断中的应用

弥漫性肺疾病是指以气腔及间质普遍受累、以X线胸片两肺4个以上肺区弥漫分布为影像特征的一组疾病，包括弥漫性肺炎、肺水肿、肺间质性疾病等。临床表现为活动性呼吸困难、限制性通气障碍、弥散功能降低和低氧血症。其疾病谱广泛，性质各异。很多患者疾病进展迅速，短期内并发呼吸衰竭甚至多脏器功能障碍，因此弥漫性肺疾病的快速精准诊断，是指导治疗和改善患者预后的关键。

胸部高分辨率CT（high Resolution CT，HRCT）检查为弥漫性肺疾病提供了广泛的鉴别诊断谱^[1]，病变性质和分布特征典型的影像改变可为弥漫性肺疾病的诊断提供直接线索。如伴有蜂窝肺的典型普通型间质性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）通过胸部HRCT就可诊断，但弥漫性肺疾病的疾病谱十分复杂，包括：肺部原发性疾病如非特异性间质性肺炎、结节病、肺泡蛋白沉积症等；结缔组织病的肺部侵犯、环境相关的肺部损害如尘肺、矽肺、过敏性肺炎等；以短期内出现并进行性加重为影像特征的肺部转移癌、支气管内或血行播散性结核、隐源性机化性肺炎等；罕见病如组织细胞增生症、淋巴管平滑肌瘤病等^[2]。这些疾病的胸部HRCT虽然都表现为弥漫性肺疾病，但疾病性质不同，影像特征差别很大，加上胸部HRCT表现存在同病异影、异病同影现象，仅凭影像变化诊断疾病，可靠性显著降低，当合并感染或多种疾病共存，影像诊断的难度进一步加大。

疾病异常影像的表现多是肺部病理改变的直接投射^[3]，掌握异常病变对应的病理组织特征对病变的精准诊断至关重要，甚至是一些典型弥漫性肺疾病诊断的金标准。准确获取足够大的病灶部位的组织标本是准确诊断弥漫性肺疾病的前提和难点。目前获取组织标本的方法主要有经支气管钳夹活检（transbronchial forcep biopsy，TBFB）、经皮肺穿刺活检（percutaneous lung biopsy，PCLB）和外科肺活检（surgical Lung Biopsy，SLB）三种途径。其中TBFB最常用，缺点是取样的组织量小，导致诊断敏感度和确诊率偏低。PCLB也是临床常用的活检方式，对肺外周病灶的活检取材优势显著，但也没有解决组织取样量小的问题，且发生出血、气胸的风险较高。SLB是诊断弥漫性肺疾病的金标准，但创伤大、费用高、受心肺功能限制、死亡风险相对较高^[4]。与TBFB和PCLB相比，经支气管冷冻肺活检（transbronchial cryobiopsy，TBCB）可结合影像变化多部位多点多次取材，而且能够提供更大和更高质量的组织（活检组织结构完整，含有更多的肺泡和小气道组织）。对疾病的诊断率高，但并发症发生率与活检钳活检相比并无明显差异，在后续的分子诊断和组织病理分析中具有较大的优势^[5-6]。

TBCB是将冷冻探头经支气管伸入至远端小支气管，利用冷冻探头在冷冻过程中的黏附性，将探头周围的肺组织暴力撕裂，获得组织学标本的一项技术^[7]。TBCB的传统适用范围主要用于弥漫性实质性肺疾病、肺外周局部病变，以及肺移植术后排斥反应监测^[8]。随着这项技术在临床的开展，TBCB已经越来越多地用于各种肺部疾病的活检取材。但是在临床应用中也同样需要严格掌握TBCB活检的禁忌证。TBCB的绝对禁忌证包括：①存在常规支气管镜检查禁忌证；②不能纠正的出/凝血功能障碍、血流动力学不稳定、严重呼吸衰竭；③已经通过HRCT等明确诊断的特发性肺纤维化。TBCB的相对禁忌证包括：①未控制的肺动脉高压或高血压；②肺功能极差，一氧化碳弥散量<35%或用力肺活量<50%；③拟活检的局限性病变靠近中大血管、空洞或肺大疱；④存在硬质支气管镜或气管插管禁忌证^[8-9]。随着临床经验的积累和技术的普及，TBCB在临床中的应用范围越来越广泛，可以应用于间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）、外周肺结节的诊断以及肺移植术后排异反应的监测。只要排除了TBCB的禁忌证，TBCB可对诊断未明的弥漫性肺疾病的鉴别诊断提供有力的技术保障。TBCB对ILD的病因诊断率可达84%以上，大大提升了弥漫性肺疾病的病因诊断率，有望替代SLB成为诊断弥漫性肺疾病的首选技术^[10-11]。

分析异常影像变化异同点的同时，综合分析相关的临床特征、病情进展速度、基础疾病、环境因素和宿主免疫状态等信息可进一步为弥漫性肺疾病的鉴别诊断提供重要线索，有时甚至成为鉴别诊断的分水岭^[12-13]。影像学在短期内动态变化提示病情变化或进展。新近出现的新发病灶或原有病变进展最常见的原因包括原有疾病急性进展和加重、合并其他非感染性疾病（如肿瘤等）、病原微生物感染导致的弥漫性肺部病变等，其中感染或原有弥漫性肺疾病合并感染导致病情进展或加重最常见，进一步增加了确诊难度。此时，在充分辨析影像和临床特征的基础上，除了及时、准确获取病灶的组织病理、宿主免疫学信息外，还要准确掌握病变的病原信息，对准确掌握疾病全貌、指导后续治疗、改善预后具有重要作用。

对于病原微生物感染导致的弥漫性肺疾病或合并感染的弥漫性肺疾病，冷冻肺活检联合宏基因二代测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）检测能进一步提高诊断的精准度，对于非感染因素导致的弥漫性疾病的进展和加重，冷冻肺活检联合mNGS具有排除诊断价值。mNGS是近期应用于临床的一种病原快速诊断技术，它不依赖于传统的微生物培养，无需特异性扩增病原体核酸^[14-15]，可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，将测序结果与数据库病原核酸序列信息进行比对，然后分析判断样本包含的病原微生物种类与核酸序列数，能够快速、客观地检测临床样本中存在的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），mNGS检测明显提高了病原检测的敏感度，缩短了检测时间，尤其适用于急危重症和疑难感染的快速诊断，已被多部感染性疾病诊治相关的指南和专家共识推荐^[16]。依据目前的临床经验、研究成果和mNGS技术特点，推荐mNGS在感染性疾病中应用的主要适应证包括^[16]：①病情危重需要尽快明确病原体；②特殊患者（如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者）需要尽快明确病原体；③传统微生物检测技术结果反复阴性且治疗效果不佳；④疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性；⑤疑似特殊病原体感染；⑥长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。符合以上适应证的患者，应尽快送标本进行检测。

mNGS联合冷冻肺活检和/或支气管肺泡灌洗能对肺部弥漫浸润性疾病的快速精准诊断提供更加全面客观的鉴别诊断信息：①对于由病原微生物感染导致的弥漫性肺疾病（如卡氏肺孢子菌肺炎、肺结核、肺部细菌感染、组织胞浆菌病、病毒性肺炎、混合感染等）^[17]，mNGS联合冷冻肺活检和/或支气管肺泡灌洗为临床提供快速、精准的组织病理学，病原形态学（特殊染色等），核酸，宿主免疫信息等多维度的感染免疫信息，指导优化抗感染药物治疗，减少抗感染药物的附加损害^[18-19]。②对于非感染性弥漫性肺疾病的急性加重，如特发性间质性肺炎（idiopathiciInterstitial pneumonia，IIP）、结缔组织病肺间质病变（connective tissue disease-interstitial lung disease，CTD-ILD）的急性加重、隐源性机化性肺炎（cryptogenic organizing pneumonia，COP）、药物性肺病（drug-induced lung disease，DILD）等，影像学特征表现为急性加重的弥漫性肺部浸润影（acute exacerbation of diffused pulmonary infiltration，AE-DPI），临床诊断与感染难以鉴别时，mNGS联合冷冻肺活检和/或支气管肺泡灌洗对感染性疾病导致的AE-DPI具有排除诊断价值。③对于原有弥漫性肺疾病合并肺部感染（如UIP、NSIP、IIP、CTD-ILD合并病原体感染），mNGS联合冷冻肺活检和/或支气管肺泡灌洗既可明确肺部基础病变特征，又可提供病原感染的证据，为指导临床治疗药物的增减和优化抗感染治疗方案提供了双重保障。

综上所述，对弥漫性肺疾病的快速精准诊断，在充分辨析HRCT特征的基础上，详细了解相应的临床特征，在掌握临床适应证的前提下，进行严密的监护，应用TBCB技术及时对病灶部位取材，获取充分的组织标本，联合支气管肺泡灌洗等手段，对活检及灌洗标本进行组织病理、免疫组化及特殊染色，联合mNGS及传统病原检测手段（涂片、培养、PCR、抗原/抗体），将相应信息进行有机整合，形成疾病精准诊断的证据链，对实现弥漫性肺疾病的快速精准诊断具有很好的可行性，同时，对后续治疗策略的优化、降低医疗成本亦具有重要的指导作用。相信随着各种检测技术的进一步升级优化，弥漫性肺疾病的快速精准诊断效能会进一步得到提升。

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